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黃瓜籽為葫蘆科植物黃瓜 Cucumber sativus L．的干燥 成熟種子?！吨腥A本草》中記載其具有續(xù)筋接骨、祛風(fēng)、消 痰的功效，主治骨折筋傷、風(fēng)濕痹痛、老年痰喘［1］。黃瓜籽 中富含有多種氨基酸、活性肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，能維持人體 的骨代謝，調(diào)節(jié)鈣、磷代謝和骨容量，還具有聚集骨生長因 子及誘導(dǎo)骨生長因子分泌的作用。黃瓜籽中含有多種營養(yǎng)成 分，其中包含大量人體必需的脂肪酸、植物甾醇、糖和苷類、 揮發(fā)油以及多種無機(jī)鹽等 [2,3]，但其所含總多糖、總皂苷及總 黃酮的含量尚未見報(bào)道。本研究采用紫外分光光度法對黃瓜 籽中以上三類物質(zhì)的含量進(jìn)行分析，為下一步藥理實(shí)驗(yàn)提供 依據(jù)。為葫蘆科甜瓜屬植物黃瓜 (Cucumis sativ us L.) 的干燥成熟種子，使用前烘干并粉碎成粗粉。 葡萄糖對照品，批號(hào) 110833- 200503；牛血清白蛋白對照品， 批號(hào) 140619-200919；蘆丁對照品，批號(hào) 100080-201408；薯 蕷皂苷元對照品，批號(hào) 111539-200001；以上對照品均購自于 中國藥品生物制品檢定所。蒽酮、濃硫酸、乙醇、丙酮、正丁醇、石油醚等均為分析純，D101 大孔吸附樹脂（天 津市匯達(dá)化工）、考馬斯亮藍(lán)（天津科密歐試劑）等。 2 方法與結(jié)果 2.1 黃瓜籽多糖的提取與含量測定 2.1.1 多糖的提取 [4] 稱取黃瓜籽粗粉 100g，加 5 倍量 90% 乙醇加熱回流提取 3 次，每次 2 h，過濾，合并濾液， 濾液回收乙醇。濾渣揮干乙醇，加水煎煮 3 次，每次 2 h，合 并濾液，加熱濃縮至 60 ml，加 95% 乙醇調(diào)至溶液的乙醇濃度 為 80%，Sevage 法除蛋白后，于 4℃ 靜置過夜，抽濾，沉淀 依次以無水乙醇、丙酮洗滌，并于 60 ℃ 烘干，得到粗多糖 提取物。 2.1.2 黃瓜籽多糖的含量測定 2.1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 [5] 精密稱取 105℃干燥至恒重 的無水葡萄糖對照品約 10mg，置于 100ml 容量瓶中，加蒸餾表 1 膽酸線性范圍測定結(jié)果 濃度（mg/ml） 0.00677 0.0135 0.0203 0.0270 0.0338 吸收度 0.1430 0.2768 0.3915 0.5389 0.6732 線性方程為：y=0.00793+19.53x 相關(guān)系數(shù) r=0.9994，測 定結(jié)果表明膽酸在 0.00677~0.6732mg/ml 濃度范圍內(nèi)與吸收 度有良好線性關(guān)系。 4.3 討論 通過對牛黃清感膠囊的薄層色譜分析，可以很好地鑒別 人工牛黃。結(jié)果斑點(diǎn)清晰，陰性無干擾，專屬性強(qiáng)；利用工 作曲線法測定處方中人工牛黃的膽酸含量，為牛黃清感膠囊 質(zhì)量的定量控制奠定了基礎(chǔ)。

水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得 0.10 g /L 的葡萄糖對照 品溶液。再取上述對照溶液適量分別加水配成 0,0.02,0.03, 0.04,0.06,0.08,0.10g/L 的 溶 液，分別吸取不同濃度溶 液1ml置 10 ml具塞試管中，每管各加入0.2% 蒽酮 - 硫 酸溶液 4 ml，待各管加完后同時(shí)搖勻，置于沸水中加熱 15min，取出后迅速置于冷水中冷卻至室溫，放置10min， 于 627nm 處測定吸光度，以葡萄糖濃度C為橫坐標(biāo)，吸光 度 A 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=0.0072X+0.0044 (R2=0.9992)，表明樣品在 0.00 ～ 0.10g/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系 良好。 2.1.2.2 黃瓜籽多糖的含量測定 精密稱取干燥至恒重的黃 瓜籽粗多糖樣品 10mg，置于 100ml 容量瓶中，加蒸餾水溶解 并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為 0.1 g/L的黃瓜籽粗多糖溶液。 精密吸取黃瓜籽粗多糖溶液 1.0 ml，按 2.1.2.1 項(xiàng)下方法測 定吸光度，由回歸方程計(jì)算樣品中總多糖含量。 2.1.3 結(jié)果 2.1.3.1 Sevage 法除蛋白結(jié)果 粗多糖樣品經(jīng)Sevage 法 多次除蛋白，以牛血清白蛋白為對照品，通過考馬斯亮藍(lán)法 （UV,595nm) 測定殘留蛋白的含量，結(jié)果見表 1。 樣品處理 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 蛋白含量 % 除蛋白前 Y=0.0083X+0.0502 
(R2=0.9996)
33.18 第三次除蛋白 14.87 第五次除蛋白 14.51 第六次除蛋白 14.41 由表 1 可見，第五次、第六次除蛋白后樣品中殘留蛋白 含量分別為 14.51% 和 14.41%，含量變化不大，因此不再繼續(xù) 除蛋白。 2.1.3.2 粗多糖提取物性狀、提取率及含量 黃瓜籽粗多糖 提取物為白色粉末狀，得率為 4.59%。粗多糖提取物中多糖含 量為 23%，占生黃瓜籽的 1.06%。 2.2 黃瓜籽總黃酮含量測定 2.2.1 總黃酮提取物的制備 [6] 稱取黃瓜籽粗粉 500g，加 4 倍量石油醚于 50℃ 水浴中加熱回流提取 3 次，每次 2 h， 濾過，合并濾液，回收石油醚除去脂肪油部分，藥渣置通風(fēng) 處放置揮干石油醚，加入 3 倍量 75% 乙醇溶液，加熱回流提 取 3 次，每次 2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮，將濃縮液 均分成兩份，冷藏一份備用。另一份加 100ml 蒸餾水混勻， 經(jīng)大孔吸附樹脂 D101（已經(jīng)預(yù)處理）分離純化，先用 3BV 蒸 餾水靜止吸附 24h，再依次加入 2BV 的 20% 乙醇洗脫、2BV 的 50% 乙醇洗脫、4BV 的 75% 乙醇進(jìn)行洗脫，合并洗脫液，回收 乙醇 , 干燥即得總黃酮粗提物。 2.2.2 總黃酮的含量測定 2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 [7] 精密稱取蘆丁對照品 0.1260g 置于 10ml 容量瓶中，加70%乙醇溶液使之溶解并定容至刻 度，搖勻，即得蘆丁對照品溶液。精密吸取蘆丁對照品溶液 0, 1, 2, 3, 4, 5 ml，分別置于 10ml 容量瓶中，加 0.05g/ml 亞硝酸鈉溶液 0.3ml，搖勻后放置 6min，加 0.1g/ml 硝酸鋁 溶液 0.3ml，搖勻后放置 6min，加 1.0mol/L 氫氧化鈉溶液 4.0mL，再用 70% 乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置 15min。 于 510nm 測定吸光度值，得到回歸方程為 Y=0.0115X-0.0094 (R2=0.9990)，表明樣品在 0.00 ～ 0.756 g/L 范圍內(nèi)線性關(guān) 系良好。 2.2.2.2 總黃酮的含量測定 精密稱取 2.2.1 處理好的總黃 酮樣品 0.5213g 于 10ml 容量瓶中，加 70% 乙醇溶解并定容至 刻度，搖勻，再準(zhǔn)確吸取 1ml 溶液于 10ml 容量瓶中，按照標(biāo) 準(zhǔn)溶液制備方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并測定吸光度。 2.2.3 結(jié)果 經(jīng)上述制備方法得到的總黃酮樣品為1.0665g，得率為 0.43%。根據(jù)回歸方程計(jì)算提取物中總黃酮含量為 67.98%，占生藥量的 0.29%。 2.3 黃瓜籽總皂苷的提取分離及含量測定 2.3.1 總皂苷的提取分離[8] 取 2.2.1 中冷藏儲(chǔ)備樣品 17.97g加5倍體積的蒸餾水溶解，用乙酸乙酯萃取兩次，每 次 90ml，水層再用水飽和正丁醇萃取三次，每次 90ml，合并 正丁醇層，回收正丁醇，干燥即得黃瓜籽總皂苷提取物。 2.3.2 總皂苷的含量測定 2.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 [9] 精密稱定薯蕷皂苷元對照品約 3mg, 置于 10ml 容量瓶中 , 加甲醇溶解并定容，得到對照品 溶液。精密吸取對照品溶液 0，0.3，0.4, 0.6, 0.8, 1.0ml 分別置于 10ml 容量瓶 , 揮干溶劑 , 加高氯酸至刻度，搖勻， 65℃水浴加熱顯色 15 min，取出后立即置于冰水浴中 15min 后停止反應(yīng)，于 410 nm 波長處測定吸光度值。計(jì)算得回歸方 程為 Y = 8.348X+ 0.078（R2= 0.997），結(jié)果表明薯蕷皂苷 元在 0.0 ～ 0.3 g /L 范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。 2.3.2.2 樣品總皂苷的含量測定 稱取2.3.1 中得到的總 皂苷提取物0.3456g 于 10 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并定 容，準(zhǔn)確吸取 1ml 于 10ml 容量瓶中，同法制成樣品溶液并于 410nm 波長處測定吸光度。 2.3.3 結(jié)果 上述制備方法得到黃瓜籽總皂苷1.45g，提 取率為 0.58%，根據(jù)回歸方程計(jì)算得提取物中總皂苷含量為 30.22%，占生藥量的 0.18%。 3 討論 總多糖提取物中 , 常伴有無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、色素及醇不 溶性小分子有機(jī)物 ( 如低聚糖 ) 等雜質(zhì) , Sevage 法是常用的 除蛋白方法。本研究經(jīng) 6 次除蛋白后，殘留蛋白含量相對穩(wěn) 定，可能是糖與蛋白形成糖蛋白復(fù)合物 , 使蛋白質(zhì)的脫除更 加困難。黃瓜籽經(jīng)提取分離得到的提取物中總黃酮含量達(dá)到 67.98%，說明此方法應(yīng)用于黃瓜籽總黃酮的分離純化良好； 另一提取物中總皂苷含量為 30.22%，由于方法中采用溶劑萃 取法進(jìn)行分離達(dá)不到更好地純化皂苷的作用，還需進(jìn)一步通 過離子交換樹脂等方法進(jìn)行純化。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹皇菫榱藱z 測黃瓜籽中總黃酮、總皂苷及總多糖的含量，三種物質(zhì)中總 多糖的含量高，總皂苷的含量低，其次是得到各有效組 份提取物用于抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)理研究。